طراحی و ابداع روشی برای تائید ساب کلونینگ مولکولی با استفاده از تکنیک "تکثیر حاصل از جابه جا سازی متعدد"

چکیده طراحی و ابداع روشی برای تائید ساب کلونینگ مولکولی با استفاده از تکنیک "تکثیر حاصل از جابه جا سازی متعدد" (multiple displacement amplification) به کوشش سعید صابرالشعرا ساب کلونینگ مولکولی ژن، یکی از مهمترین و پرکابردترین مراحل انجام آزمایش های مولکولی می باشد. در مراحل انجام ساب کلونینگ، علاوه بر واکنش کلونینگ، تشخیص و تایید انجام موفقیت آمیز ساب کلونینگ نیز دارای اهمیت فراروانی است. روش های معمول برای تایید ساب کلونینگ شامل جمله برش وکتور و بررسی سایز قطعات، تکثیر وکتور با انجام واکنش زنجیره ای پلی مراز به طور مستقیم روی کلنی های باکتریایی حاوی پلاسمید یا بر روی پلاسمید استخراج شده، و تعیین توالی پلاسمید به منظور یافتن توالی قطعه ساب کلون شده استفاده می شود. هر کدام از این تکنیک ها دارای مشکلات و معایبی هستند. برای مثال برای برش های آنزیمی لازم است وکتور خالص شده و سپس طی صرف زمان خاصی برش داده شود. این روش در همه موارد نیز به یک پاسخ قطعی منجر نمی شود. برای واکنش زنجیره ای پلی مراز نیز بهتر است پلاسمید خالص سازی شود چرا که این واکنش به پروتئین ها و ترکیبات سلولی حساس بوده و در هنگم استفاده مستقیم از کلنی در جریان واکنش می تواند به راحتی مهار شود. در این طرح بر آن شدیم تا با استفاده از تکنیک "تکثیر حاصل از جابه جا سازی متعدد (multiple displacement amplification; mda)" بتوانیم به راحتی و بدون صرف هزینه های مالی و زمانی زیاد و با دقت فراوان، انجام موفقیت آمیز واکنش ساب کلونینگ را تایید کنیم. بدین منظور از چند جفت پرایمر اختصاصی نستد (nested) تنها بر روی یک رشته و آنزیم فای پلی مراز 29 (f 29 dna polymerase) روی محصول و کلنی های حاصل از لایگیشن (ligation) استفاده شد. ابتدا ساب کلونینگ به طریق کلاسیک خود انجام گردید. در یک حالت محلول حاصل از لایگیشن وارد واکنش شد و در حالت دیگر به داخل باکتری فرستاده شد. به این نمونه های حاوی محصول لایگیشن یا کلنی های به دست آمده پرایمر های اختصاصی به تعداد حداقل 4 عدد بر روی یک رشته با فاصله تقریبا 100 باز از یکدیگر، آنزیم فای پلی مراز 29 ، نوکلئوتیدهای چهارگانه، و بافر اضافه گردید. پرایمرها دارای تغییر (اتصالات تیوفسفات) در دو باز انتهایی خود بودند (5_-npnpnpnpsnpsn-3_) که باعث می شود در برابر اگزونوکلئازها مقاومت نشان دهند. نتایج بدست آمده در هر دو مورد آزمایش شده و نمونه هایی که به عنوان کنترل منفی درنظر گرفته شده بود، درستی طراحی روش را نشان می داد، بطوری که نمونه هایی که دارای ژن کلون شده بودند، پس از انجام واکنش با آنزیم فای پلی مراز، باند dna مشخصی را روی ژل الکتروفورز نشان می دادند. کلمات کلیدی : ساب کلونینگ مولکولی، تکثیر حاصل از جابه جا سازی متعدد، فای 29 پلی مراز